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1 引言

　　抗生素在医学、农业和兽药上的过度使用导致全球范围内的抗生素抗性菌(以下简称“抗性菌”)广泛传播.目前，抗性菌传播已成为全世界面临的一个严重健康隐患，在土壤、水体或空气等不同环境介质中均发现有较高比例的抗性菌或抗性基因存在.例如，对北京温榆河流域水体中抗生素抗性大肠杆菌进行调查发现，水体中各类抗生素抗性大肠杆菌普遍存在，并且许多菌株同时具有对多种抗生素的抗性.

　　作为各种污水和排泄物的集中处理场所，城市污水处理厂是抗生素及抗性菌的汇集地.研究表明，城市污水处理厂出水中存在相当比例的抗性菌，是导致自然水体抗性菌污染的一个重要污染源.因此，研究和认识污水处理厂出水中抗生素抗性菌的种类和特性，对于污水处理和回用的生物风险评价和控制十分重要.目前，关于污水处理厂排放抗性菌的研究大多针对总异养菌群开展，缺乏关于菌种构成和特性的报道，因此，有必要加强相关研究.

　　四环素类抗生素在我国作为人用或兽用药品被广泛使用.本研究从城市污水处理厂二级处理出水中分离出21株四环素抗性菌株，在鉴定抗性菌菌属的基础上，考察各菌株的生长特性和对6种常用抗生素(青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素、四环素和利福平)的耐药性，以期为评估我国污水处理厂抗性菌风险提供基础数据.

　　2 材料与方法

　　2.1 水样

　　试验水样取自北京市某城市污水处理厂的二级处理出水，该污水处理厂主体工艺采用A2/O工艺.取样设备均经过消毒处理，样品保存于冰盒运回实验室，保存于4 ℃冰箱，在4 h内进行抗性菌分离工作.

　　2.2 抗性菌的分离与菌属鉴定

　　采用涂布法将二级处理出水接种于含16 mg · L-1四环素的营养琼脂(g · L-1：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5，琼脂15)中，于37 ℃培养箱中培养24~48 h后，挑取单个菌落于含16 mg · L-1四环素的营养琼脂上划线分离2次.

　　将所分离的菌落进行16S rRNA的PCR扩增与序列测试(TaKaRa公司).测序结果与GenBank进行比对，获取菌株的分类菌属.

　　2.3 抗性菌的质粒检测

　　将所分离获得的菌落接种于含16 mg · L-1四环素的营养肉汤培养基(g · L-1：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5)中，过夜培养16 h，用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)对新鲜菌液进行质粒提取后，采用琼脂糖凝胶电泳确定质粒是否存在.

　　2.4 抗性菌生长特性 2.4.1 抗性菌生长曲线测定

　　将所分离的菌落接种于含16 mg · L-1四环素的营养肉汤培养基中，每2 h测定OD600，12 h后每隔4~8 h测定OD600，至菌株生长进入衰亡期.

　　2.4.2 抗性菌生长动力学参数确定

　　四环素抗性菌的生长曲线呈S型，用S-Gompertz模型进行拟合，获得四环素抗性菌的最大生长量、最大比生长速率和迟滞时间.S-Gompertz模型是细菌生长曲线拟合的常用模型，具体数学表达式如下：

　　式中，N为某生长时间t下细菌悬浊液在600 nm波长下的吸光度值(cm-1);N0为细菌悬浊液在600 nm波长下的初始吸光度值(低于检测限，则初始值定为0.001)(cm-1);Nm为细菌的最大生长量，即细菌悬浊液在600 nm波长下的最大吸光度值(cm-1);μm为细菌的最大比生长速率(h-1);λ为迟滞时间(h);t为生长时间(h).

　　2.5 四环素抗性菌对6种典型抗生素的耐受性分析 2.5.1 抗生素母液配制

　　分别配制浓度为2048 mg · L-1的青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素、四环素和利福平水溶液.溶液采用高纯水配制，所配溶液用0.22 μm滤头过膜除菌后，-20 ℃保存，时间不超过1周.

　　2.5.2 抗生素耐受性试验

　　抗生素耐受性试验采用微量液体稀释法.将所分离鉴定的菌株接种于含16 mg · L-1四环素的营养肉汤培养基中，培养至对数生长期.所获得的新鲜菌液接种于含不同浓度梯度抗生素的营养肉汤培养基中(采用96孔U型培养板)，在37 ℃经18 h培养，测定OD600.所测定抗生素包括青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素、四环素和利福平;抗生素浓度梯度设定为0、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024 mg · L-1.

　　2.5.3 抗性菌对不同抗生素的耐受性评价

　　用于评价的指标主要包括存活率S、最小抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)、半抑制浓度IC50、抗生素抗性指数(Antibiotic Resistance Index，ARI)、典型病原抗性菌的最小抑制浓度界定最大值MICd，其定义及计算公式分别如下：

　　式中， OD600ji 为加入抗生素j的第i试验组在600 nm波长下的吸光度值(cm-1)，抗生素j包括青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素、四环素和利福平; OD′600ji 为加入抗生素j的第i组培养基在600 nm波长下的吸光度值(cm-1); OD0600 为对照组(即不加抗生素但加菌液)在600 nm波长下吸光度值(cm-1); OD′0600 为营养肉汤培养基在600 nm波长下吸光度值(cm-1).

　　最小抑制浓度(MIC)定义为存活率小于1%(试验组显色低于酶标仪检出限)时抗生素的折点浓度.通过四参数逻辑斯蒂方程(公式(3))拟合抗生素抑制菌株的剂量效应曲线，并通过拟合曲线的参数确定半抑制浓度IC50，曲线拟合采用Origin8.0软件完成.抗生素抗性指数ARI计算如式(4)所示.

　　式中，A1为无抗生素添加的效应值，设定初始值为100;A2为抗生素添加足够多时的效应值，设定初始值为0;x0为半抑制浓度(即IC50)(mg · L-1);x为添加的抗生素浓度(mg · L-1);p为曲线坡度参数.

　　根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)抗生素试验标准，青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素、四环素和利福平对典型病原菌的最小抑制浓度界定(抗性界定)最大值MICd分别为16、32、32、32、16、4 mg · L-1.

　　3 结果与讨论

　　3.1 污水处理厂二级出水中四环素抗性菌菌种构成

　　经过3次分离培养，从所选取污水处理厂二级出水中共获得21株四环素抗性菌.16S rRNA鉴定结果表明，这些四环素抗性菌株分布于6个属，结果如表 1所示.从分类学上划分，这些菌株均属于肠杆菌(Enterobacteriaceae)科.从菌株数来看，气单胞菌属、埃希氏菌属和肠杆菌属细菌较多.

　　表1 二级出水中分离出21株四环素抗性菌的属分布

　　气单胞菌属于革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧条件生长，属于条件致病菌，易导致肠胃疾病及伤口感染.柠檬酸杆菌属于革兰氏阴性菌，是大肠菌群中的一类.肠杆菌属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧条件生长，属于卫生部发布的《人间传染的病原微生物名录》中第三类病原微生物，常见于尿道和呼吸道感染中.埃希氏菌属于革兰氏阴性菌，大部分埃希氏杆菌为非致病性菌，只有少数(如E.coli O157：H7)具有致病性.哈夫尼菌属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧条件生长，属于条件致病菌.克雷伯氏菌属于革兰氏阴性菌，是一类常见的条件致病菌，可引起肺部、尿道和软组织感染.通过以上分析发现，污水处理厂二级出水中的四环素抗性菌大多属于条件致病菌.这些菌携带有抗生素抗性或抗性升高将增加污水处理厂二级出水的风险.

　　3.2 四环素抗性菌质粒携带情况

　　对所分离的四环素抗性菌进行质粒提取和凝胶电泳分析，发现21株四环素抗性菌中有18株(7株气单胞菌、5株埃希氏菌、2株肠杆菌、2株克雷伯氏菌、1株哈夫尼菌、1株柠檬酸杆菌)携带质粒，另外2株气单胞菌和1株肠杆菌不携带质粒.不同菌种所携的带质粒大小不一，但均大于2 kb.有关研究表明，具有四环素抗性的革兰氏阴性菌通常含有大质粒，且这些质粒多为结合性质粒.结合性质粒具有携带多种抗性基因(如其他类型抗生素、抗金属基因)和病原因子基因(如毒素基因)的潜力.与其他类型质粒相比，结合性质粒具有较强的传播能力.因此，城市污水处理厂出水中四环素抗性菌所携带质粒可能导致抗生素抗性基因的传播.

　　3.3 四环素抗性菌生长特性

　　抗性菌的生长特性能够反映其在环境中的增殖能力.本文分别测定了21株四环素抗性菌的生长曲线，并用S-Gompertz模型(公式(1)和(2))拟合，获得各菌株最大生长量(Nm)、最大比生长速率(μm)和迟滞时间(λ)，具体如表 2所示.

　　表2 四环素抗性菌的最大生长量(Nm)、最大比生长速率(μm)和迟滞时间(λ)

　　由表 2可以看出，所分离的四环素抗性菌的最大生长量(以OD600计)在1.0~2.3之间，气单胞菌、埃希氏菌的平均最大生长量显著高于肠杆菌(p<0.05)，其他菌株间的最大生长量无显著差别.这表明气单胞菌和埃希氏菌利用碳源和合成菌体的能力更强、效率更高，也可能是这些菌在污水处理厂出水中种类数上占有优势的原因.四环素抗性菌的最大比生长速率在0.6~3.49 h-1之间，气单胞菌的最大比生长速率显著低于埃希氏菌和柠檬酸杆菌(p<0.05)，其他菌种间的最大比生长速率无显著差别.各菌属的迟滞时间在统计学上无显著差别，大部分菌株的迟滞时间在2 h以内.从单一菌种来看，个别菌株的迟滞时间较长，有3株气单胞菌的迟滞时间大于6 h，1株埃希氏菌的迟滞时间接近10 h.

　　3.4 四环素抗性菌对不同抗生素的耐受性 3.4.1 最小抑制浓度

　　从污水处理厂出水中分离出的21株四环素抗性菌对6种抗生素的最小抑制浓度分布如图 1所示.由图 1可知，所分离的21株四环素抗性菌中，有20株菌对氯霉素的MIC和10株(含)以上菌对青霉素、氨苄青霉素和头孢噻吩的MIC不小于1024 mg · L-1，这说明污水中四环素抗性菌对氯霉素和β-内酰胺酶类抗生素(青霉素、氨苄青霉素和头孢噻吩)的耐受能力普遍较高.同时，21株四环素抗性菌对四环素的MIC主要集中在256 mg · L-1左右，对利福平的MIC呈两极分布.综上所述，分离所得的21株四环素抗性菌对氯霉素的耐受能力最强，对β-内酰胺酶类抗生素的耐受性次之，对利福平的耐受性最弱.这与有关污水处理厂出水中总异养菌群对不同抗生素耐受性的研究结果类似.

　　图 1 四环素抗性菌对6种抗生素的最小抑制浓度分布

　　与CLSI试验标准中青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素和利福平对典型病原微生物的抗性界定浓度相比较，分别有95.2%、95.2%、76.2%、100%和81.0%四环素抗性菌株的MIC不小于抗性界定浓度，即所分离获得的四环素抗性菌株中分别有95.2%、95.2%、76.2%、100%和81.0%的菌株具有青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素和利福平抗性.因此，污水中的四环素抗性菌同时具有多种其他抗生素抗性.

　　3.4.2 抗生素抗性指数

　　根据2.5.3节描述的方法，在大量试验的基础上确定了四环素抗性菌对6种抗生素的抗性指数，结果如图 2所示.由图 2可以看出，污水处理厂二级处理出水中四环素抗性菌对氯霉素和四环素的抗性分布较为集中，而对青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩和利福平的抗性分布范围较宽.从抗性指数的中值来看，四环素抗性菌对不同抗生素的耐受性顺序与最小抑制浓度分析结果基本相同，耐受性由高到低分别为氯霉素、青霉素、氨苄青霉素、四环素、头孢噻吩和利福平.具体参见污水宝商城资料或http://www.dowater.com更多相关技术文档。

　　图 2 四环素抗性菌的6种抗生素抗性分布

　　4 结论

　　1)从北京市某城市污水处理厂出水中分离出21株四环素抗性菌，经鉴定为均为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌，分别属于气单胞菌(9株)、埃希氏菌(5株)、肠杆菌(3株)、克雷伯氏菌(2株)、柠檬酸杆菌(1株)和哈夫尼菌(1株).其中，有18株细菌携带有质粒.

　　2)21株四环素抗性菌中，气单胞菌、埃希氏菌的平均最大生长量显著高于肠杆菌.四环素抗性菌的最大比生长速率在0.6~2.3 h-1之间，气单胞菌的最大比生长速率显著低于埃希氏菌和柠檬酸杆菌.大部分菌株的迟滞时间在2 h以内，各菌属间无显著差别.

　　3)关于最小抑制浓度和抗性指数的分析结果表明，四环素抗性菌对氯霉素的耐受能力最强，对β-内酰胺酶类抗生素的耐受性次之，对利福平的耐受性最弱.75%以上的四环素抗性菌同时表现出对其它5种抗生素(青霉素、氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素和利福平)具有抗性.